Les différences entre les bactéries Gram positives et Gram négatives incluent l'épaisseur de la paroi cellulaire, qui est d'environ 20 à 30 nanomètres d'épaisseur pour les bactéries Gram positives et de 8 à 12 nanomètres pour les Gram négatifs ; la quantité de peptidoglycane dans les parois cellulaires ; et la teneur en lipides et lipoprotéines, qui est faible en bactéries Gram positives et élevée en bactéries Gram négatives. En utilisant le processus de coloration de Gram, les bactéries Gram positives donnent une teinte violette, tandis que les bactéries Gram négatives donnent du rose.
Toutes les bactéries contiennent une couche de peptidoglycane dans leur paroi cellulaire, mais la différence entre les bactéries Gram positives et Gram négatives est que les bactéries Gram négatives ont une fine couche de peptidoglycane située entre deux couches lipidiques. C'est ce qui donne aux bactéries Gram positives une coloration rose ou rouge dans le processus de coloration de Gram. Les bactéries à Gram positif, en revanche, donnent une teinte violette ou violette en raison de l'épaisse couche de peptidoglycane située dans leurs parois cellulaires. Le procédé de coloration de Gram, découvert par Hans Christian Gram, permet d'identifier les bactéries.
Une autre différence entre les bactéries Gram positives et Gram négatives réside dans la structure des flagelles, les bactéries Gram positives contenant deux anneaux dans le corps basal et Gram négatives contenant quatre anneaux dans le corps basal. Les bactéries à Gram positif ont une sensibilité élevée aux traitements à la pénicilline et aux sulfamides, tandis que les bactéries à Gram négatif ont une faible sensibilité.