Les testicules, situés dans le scrotum, produisent et sécrètent de la testostérone. Bien qu'ils jouent un rôle moindre dans leur santé reproductive, les ovaires des femmes créent et sécrètent également de petites quantités de testostérone. Chez les deux sexes, ce sont l'hypothalamus et l'hypophyse qui déterminent la quantité de testostérone produite.
De petites quantités de cette hormone sont également sécrétées par les glandes surrénales. La testostérone est le principal androgène chez les hommes, et des niveaux accrus de cette hormone pendant la puberté entraînent le développement de la pilosité faciale, une augmentation de la taille et de la masse musculaire, une voix plus grave et une pomme d'Adam. La testostérone est également essentielle pour le développement sain du système reproducteur masculin.