Les Iroquois croyaient en plusieurs divinités, la plus importante étant le créateur des êtres humains, des plantes, des animaux et du bien dans le monde, connu sous le nom de Grand Esprit. Bien qu'ils ne croyaient pas que les humains pouvaient communiquer directement avec ces esprits, ils croyaient que c'était possible en brûlant du tabac.
Les Iroquois avaient une grande vénération pour leurs rêves, et les interprétaient et y cherchaient des signes. Ils n'avaient pas de prêtres ou de chamanes à plein temps, mais désignaient à la place des spécialistes hommes et femmes à temps partiel pour diriger les cérémonies religieuses.
Les Iroquois fabriquaient des « faux masques », qui étaient des visages sculptés dans des arbres sur pied, puis découpés, décorés et portés par la suite. Ces masques représentaient les esprits qui apparaissaient au sculpteur lors de la cérémonie du tabac effectuée auparavant.
Les hommes de la tribu chassaient et pêchaient, construisaient des maisons, défrichaient des champs pour les planter, commerçaient avec des étrangers et prenaient part à toutes les guerres. Les femmes cultivaient, élevaient des enfants, préparaient des repas et fabriquaient des paniers et d'autres ustensiles.
De nombreuses parties de la culture iroquoise impliquaient des aspects matrilinéaires. Bien que les gens se marient et divorcent et que les hommes aient souvent plusieurs épouses, lors du divorce, les enfants restent avec la mère. L'héritage a également suivi ce modèle, la propriété allant aux femmes.
Les Iroquois ne pratiquaient aucun rite de passage formalisé connu, sauf pour ceux qui prenaient une position politique.
