La spéciation, communément appelée macroévolution, est étayée par plusieurs éléments de preuve, notamment l'observation directe, la cartographie génétique et les archives fossiles. Plusieurs populations ont été observées en train de se diviser en de nouvelles espèces. La comparaison des séquences génomiques entre les espèces s'explique plus facilement en raison de l'ascendance commune récente et un vaste registre fossile a fourni de nombreux fossiles de transition.
La macroévolution a été directement observée dans un type de plante à fleurs appelée barbe de chèvre américaine. Introduites dans les Amériques depuis l'Europe au début du 20e siècle, trois espèces de barbe de chèvre ont commencé à s'hybrider à l'état sauvage. Dans les années 1950, ils avaient produit deux nouvelles variétés qui pouvaient se reproduire au sein de leurs propres populations mais pas avec les barbes de chèvre environnantes, ce qui est le critère pour être étiqueté comme une nouvelle espèce.
La comparaison génétique directe entre les humains et les chimpanzés fournit plus de preuves de la spéciation. Les humains ont 46 chromosomes, tandis que les chimpanzés et les gorilles en ont 48. Le chromosome 2 humain, cependant, a des séquences distinctes de nucléotides qui suggèrent qu'il est le résultat de la fusion entre deux chromosomes à un moment donné dans un passé relativement récent. L'explication la plus plausible de ce fait est que les humains et les chimpanzés sont étroitement liés mais divergent en espèces distinctes.
Les archives fossiles sont riches en fossiles de transition démontrant le développement de nouvelles espèces et de groupes plus importants. En particulier, les transitions des reptiles aux mammifères, des reptiles aux oiseaux et des singes aux humains sont bien mises en évidence par les fossiles.
