L'habitat naturel des chauves-souris vampires est un environnement chaud, tropical ou subtropical. Ils peuvent être trouvés à des altitudes allant jusqu'à 2400 mètres et vivent généralement dans des zones modérément éclairées.
Les chauves-souris vampires vivent en colonies d'environ 100 chauves-souris, bien qu'il puisse y en avoir jusqu'à 1 000 ou plus dans une seule colonie. Ces colonies vivent dans des grottes, des creux d'arbres, des bâtiments abandonnés, d'anciens puits de mine et d'autres endroits sombres. Ils dorment le jour, suspendus la tête en bas au sommet de leur résidence, et sortent chasser la nuit. Les chauves-souris vampires sont les seuls mammifères qui subsistent du sang chaud de leurs proies, généralement des bovins, des chevaux ou d'autres animaux de la ferme, et qui frappent depuis le sol.
